β-葡萄糖苷酶(β-Glucosidase, β-GC)試劑盒說明書 |
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β-葡萄糖苷酶(β-Glucosidase, β-GC)試劑盒說明書 微量法正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定 測定意義: β-GC(EC 3.2.1.21)廣泛存在于動物、植物、微生物和培養細胞中,催化β-糖苷鍵水解, 具有多方面生理作用:在纖維素的糖化作用中,β-GC 負責進一步水解纖維素二糖和纖維素寡糖生成葡萄糖;β-GC 水解萜烯類香氣前驅體,使糖苷鍵合態變成游離態。從而產生香味; β-GC 能夠水解植物體內野黑櫻苷,釋放 HCN,從而防止昆蟲取食。 測定原理: β-GC 分解對-硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷生成對-硝基苯酚,后者在 400nm 有大吸收峰, 通過測定吸光值升高速率來計算β-GC 活性。 自備用品: 可見分光光度計/酶標儀、臺式離心機、水浴鍋、可調式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾水 試劑組成和配制: 提取液:液體 100mL×1 瓶,4℃保存。 試劑一:粉劑×1 瓶,-20℃保存;臨用前每瓶加入 12mL 蒸餾水,充分溶解備用;用不完的試劑仍-20℃保存。 試劑二:液體 15mL×1 瓶,4℃保存。試劑三:液體 15mL×1 瓶,4℃保存。 粗酶液提取: 1、細菌或培養細胞:先收集細菌或細胞到離心管內,離心后棄上清;按照細菌或細胞數量(104 個):提取液體積(mL)為 500~1000:1 的比例(建議 500 萬細菌或細胞加入 1mL 提取液),超聲波破碎細菌或細胞(冰浴,功率 20%或 200W,超聲 3s,間隔 10s,重復 30 次);15000g 4℃離心 10min,取上清,置冰上待測。 2、組織:按照組織質量(g):提取液體積(mL)為 1:5~10 的比例(建議稱取約 0.1g 組織, 加入 1mL 提取液),進行冰浴勻漿。15000g 4℃離心 10min,取上清,置冰上待測。 測定步驟 1、分光光度計或酶標儀預熱 30min 以上,調節波長至 400nm,蒸餾水調零。 2、加樣表
充分混勻,室溫靜置 2min 后,400nm 處測定吸光值 A,計算 ΔA=A 測定管-A 對照管。每個測定管需設一個對照管。 β-GC 活力計算: a. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下標準條件下測定的回歸方程為 y=0.32x-0.0027;x 為標準品濃度(nmol/mL),y 為吸光值。 (1)按樣本蛋白濃度計算: 單位的定義:每 mg 組織蛋白每小時產生 1nmol 對-硝基苯酚定義為一個酶活力單位。 β-GC 活力(nmol/h/mg prot)=[(ΔA+0.0027) ÷0.32×V 反總]÷(V 樣×Cpr)÷T =62.5×(ΔA+0.0027)÷Cpr 需要另外測定,建議使用本公司 BCA 蛋白質含量測定試劑盒。 (2)按樣本鮮重計算: 單位的定義:每 g 組織每小時產生 1nmol 對-硝基苯酚定義為一個酶活力單位。 β-GC 活力(nmol/h/g 鮮重)=[(ΔA+0.0027)÷0.32×V 反總]÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T =62.5×(ΔA+0.0027) ÷W (3)按細菌或細胞密度計算: 單位的定義:每 1 萬個細菌或細胞每小時產生 1nmol 對-硝基苯酚定義為一個酶活力單位。 β-GC 活力(nmol/h/104cell)=[(ΔA+0.0027) ÷0.32×V 反總]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T =0.125×(ΔA +0.0027) Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mL;V 反總:反應體系總體積,0.3mL;V 樣:加入反應體系中樣本體積,0.03mL;V 樣總:加入提取液體積,1mL;W:樣本質量,g; 500:細胞或細菌總數, 500 萬;T:反應時間,0.5h。 b.用 96 孔板測定的計算公式如下標準條件下測定的回歸方程為 y=0.16x-0.0027;x 為標準品濃度(nmol/mL),y 為吸光值。 (1)按樣本蛋白濃度計算: 單位的定義:每 mg 組織蛋白每小時產生 1nmol 對-硝基苯酚定義為一個酶活力單位。 β-GC 活力(nmol/h/mg prot)=[(ΔA+0.0027)÷0.16×V 反總]÷(V 樣×Cpr)÷T =125×(ΔA+0.0027)÷Cpr 需要另外測定,建議使用本公司 BCA 蛋白質含量測定試劑盒。 (2)按樣本鮮重計算: 單位的定義:每 g 組織每小時產生 1nmol 對-硝基苯酚定義為一個酶活力單位。 β-GC 活力(nmol/h/g 鮮重)=[(ΔA+0.0027)÷0.16×V 反總]÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T =125×(ΔA+0.0027) ÷W (3)按細菌或細胞密度計算: 單位的定義:每 1 萬個細菌或細胞每小時產生 1nmol 對-硝基苯酚定義為一個酶活力單位。 β-GC 活力(nmol/h/104cell)=[(ΔA+0.0027) ÷0.16×V 反總]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T =0.25×(ΔA +0.0027)
Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mL;V 反總:反應體系總體積,0.3mL;V 樣:加入反應體系中樣本體積,0.03mL;V 樣總:加入提取液體積,1mL;W:樣本質量,g; 500:細胞或細菌總數, 500 萬;T:反應時間,0.5h。 |